Все внимание на клеточные культуры

от экспертов для экспертов

В области Life Science есть правило: клеточная биология — это не все, но без клеточной биологии все — это ничто. Почти каждая научная гипотеза, какой бы хорошей она ни была, должна сначала доказать свою состоятельность на примере элементарной единицы жизни — клетки. Поэтому клеточная культура является неотъемлемой частью фундаментальных исследований и разработки лекарственных препаратов. Выявление сложных цепей передачи сигналов, разработка медикаментов, исследования эффективности и токсичности или сокращение испытаний на животных в соответствии с правилом 3R? Вряд ли это возможно без клеточных моделей. Разнообразие клеточных линий и культуральных систем, доступных в современном мире, просто огромно. Первичные и вторичные клетки или клеточные линии, суспензионные или адгезивные, культивируемые в двух или трех измерениях? Правильный выбор имеет решающее значение для успеха вашей научной работы. Что необходимо учитывать?

Вместе с SARSTEDT у Вас есть надежный партнер для решения всех этих вопросов. Наши опытные специалисты вместе с Вами определят Ваши специфические требования и подберут оптимальное решение из нашего обширного ассортимента. Благодаря нашим высококачественным культуральным флаконам, биореакторам, системам хранения и фильтрации у нас есть подходящие инструменты для решения любых задач. Откройте для себя наши инновационные решения и воспользуйтесь нашим опытом в области клеточной биологии.

Клетки и клеточные линии: муки выбора

Первый и самый важный вопрос: какая клеточная линия даст Вам ответ на Ваш вопрос? Как первичные, так и вторичные клеточные линии могут быть полезны.

• Первичные клетки выделяются непосредственно из тканей человека или животного или жидкостей организма. Они дают более информативные результаты, чем вторичные клеточные линии, поскольку точно отражают морфологические и физиологические характеристики тканей, из которых они были получены. Однако продолжительность жизни и пролиферация ограничены и отличаются низкой скоростью, а культивирование часто требует больше времени и усилий.

• Вторичные клеточные линии, такие как клетки HeLa, HEK-293 или CHO, напротив, способны к неограниченному делению и обладают высокой жизнеспособностью (иммортализованы). Их легко выращивать по установленным протоколам, они быстрее делятся и коммерчески доступны по относительно низкой цене. Однако они воспроизводят физиологические свойства исходной ткани гораздо менее точно, чем первичные клетки.

После выбора подходящих клеток или клеточных линий для исследования стоит проверить несколько моментов:

• Подлинность: действительно ли Вы используете правильную клеточную линию или тип клеток?

• Контаминация: не загрязнена ли Ваша культура микоплазмами, вирусами, дрожжами, нет ли признаков перекрестного загрязнения другими клетками?

• Низкое число пассажей: иммортализованные клеточные линии, например, опухолевых клеток, часто отличаются высокой генетической нестабильностью и могут вырождаться после частых пассажей. Поэтому проверьте, не превышено ли число пассажей?

Условия культивирования: все должно соответствовать!

Независимо от того, работаете Вы с первичными клетками или вторичными клеточными линиями, конкретные условия культивирования играют решающую роль. Начинать следует с выбора оптимального культурального сосуда .

Клетки, прилипающие к поверхности, имеют иные потребности, чем клетки, культивируемые в суспензии:

• Гидрофильные культуральные сосуды обеспечивают адгезивным клеткам оптимальный субстрат для культивирования. Они способствуют первоначальной адсорбции и последующей адгезии клеток.

• Гидрофильные культуральные сосуды с дополнительными полярными группами облегчают адсорбцию и адгезию первичных клеток или чувствительных клеточных линий.

• Гидрофобные культуральные сосуды, в свою очередь, уменьшают адгезиюсуспензионных клеток и удерживают их в растворе.

Особенно при работе с адгезивными клетками поверхность культурального сосуда должна быть абсолютно ровной, чтобы Ваши клетки образовывали равномерный клеточный слой и не оседали по краям.

В зависимости от области применения для этих целей предлагаются различные культуральные сосуды:

• Флаконы: для большого количества клеток, высокая степень защиты от загрязнения благодаря завинчивающейся крышке

• Чашки: для среднего количества клеток

• Планшеты: для небольшого количества клеток, например, в параллельных опытах

Помимо правильного выбора сосуда для культивирования, решающую роль играют выбор культуральной среды, воздействие внешних условий и человеческого фактора.

Трехмерные клеточные культуры: округляемся!

Классические двумерные клеточные культуры подходят для решения многих фундаментальных исследовательских задач. Однако результаты одного слоя идентичных клеток могут быть перенесены на ткань лишь в очень ограниченной степени — не говоря уже об органе или целом организме.

Сфероидные культуры позволяют максимально приблизиться к решению задачи такой сложности и играют все более важную роль в биологических исследованиях:

• Они образуют контакты «клетка-клетка» и «клетка-матрикс».

• Они могут состоять из различных типов клеток.

• Их 3D-структура обеспечивает широкий ассортимент питательных веществ, кислорода или активных ингредиентов.

• Именно они закрывают зазор между in vitro и in vivo.

• Кроме того, они могут способствовать сокращению количества испытаний на животных.

BIOFLOAT^TM: быстрый и воспроизводимый путь к созданию сфероидной культуры

В идеале однородные сфероиды можно создавать быстро и воспроизводимо — даже при работе с особо требовательными линиями. Правильно подобранный планшет для культивирования клеток может значительно облегчить Вашу работу и обеспечить значительно лучший результат.

Благодаря своей прочной и антивысокоадгезивной поверхности BIOFLOAT^TM обеспечивает преимущественное формирование контактов между адгерентными клетками. По сравнению с другими антиадгезивными поверхностями, для Вашей 3D-культуры это обеспечивает следующие преимущества:

• Ускоренное формирование сфероидов уже через 2–24 часа в зависимости от клеточной линии

• Высокая воспроизводимость благодаря очень однородным, круглым сфероидам

• Надежное формирование сфероидов, даже при работе с требовательными клеточными линиями

Являясь 96-луночным планшетом для клеточных культур, размеры которого соответствуют стандарту ANSI/SLAS, BIOFLOAT^TM обладает всеми характеристиками для автоматизированных высокопроизводительных процедур, выполняемыми, например, на доклинической стадии исследования лекарств, в токсикологических исследованиях и в исследованиях онкологических заболеваний.

Вставки TC для сложных экспериментов в культуре клеток и тканей

Наряду со сфероидными культурами условия in vivo также могут быть созданы с помощью планшетов для выращивания клеточных культур и соответствующих культуральных вставок :

• Двухкамерная система обеспечивает клеткам среду, схожую с условиями in vivo.

• Вставки оснащены ультратонкой микропористой мембраной, которая обеспечивает оптимальную адгезию клеток.

Двухкамерная система позволяет проводить сложные эксперименты, например, исследования транспорта, секреции и диффузии, совместное культивирование, эксперименты с трехмерными клеточными культурами, такими как органотипические модели эпидермиса, и многое другое.

Все внимание на клетки: продукты для микроскопии клеток

Молочная пленка на дне культурального сосуда, тусклое мерцание в среде суспензионной культуры — всё, что удастся увидеть невооружённым глазом. Клетки млекопитающих имеют размер от 1 до 30 мкм, а клетки человека — в среднем около 25 мкм. Состояние или рост вашей клеточной культуры можно оценить только с помощью световой микроскопии. Дополнительные детали (например, специфические органеллы, поверхностные молекулы или экспрессию определенных генных продуктов) можно обнаружить после соответствующего окрашивания или метки — например, с помощью флуоресцентного микроскопа.

Система культивирования клеток: биореактор miniPERM^®

Эффективное производство биомассы или клеточных продуктов, таких как белки, в больших количествах в обычных культуральных флаконах является сложной задачей. Помимо кропотливой работы, этот процесс также требует наличия необходимого пространства в инкубаторе.

Вместо этого Вы можете использовать биореактор, который непрерывно снабжает клетки средой, выводит продукты метаболизма и обеспечивает максимальный выход продукции.

В лабораторных условиях важен не только максимальный выход продукции, но и простота в обращении. Производство в биореакторе miniPERM® идеально подходит для этого.

• Продуманный дизайн: производственный модуль объемом 35 или 50 мл отделен от модуля питания объемом 400 мл диализной мембраной и обеспечивает эффективное питание ваших клеток. Ваш продукт (< 12,5 kD) остается в производственном модуле.

• Высокая плотность клеток: можно получить до 1х10⁷ клеток/мл, что соответствует примерно 20 большим культуральным флаконам или трем роллерным бутылям объемом 1 л.

• Оптимальный газообмен: снаружи производственного модуля располагается силиконовая мембрана, пропускающая O₂ иCO_2.

• Универсальность: возможность культивирования широкого спектра клеток млекопитающих, растений и насекомых.

• Экономия пространства и простота: с помощью универсального вращающего устройства в инкубаторе можно разместить до четырех биореакторов, не занимая много места.

Решение проблем: как их избежать

Несмотря на всю аккуратность и опыт в работе, дьявол иногда кроется в деталях. Типичные проблемы и как их избежать:

• Пипетирование: Быстрое пипетирование подвергает клетки стрессу, что в худшем случае может привести к их разрушению под воздействием сдвигающих усилий. При смене среды наконечник пипетки не должен касаться дна культурального сосуда, чтобы не повредить клеточный слой.

• Центрифугирование: Продолжительность и скорость центрифугирования должны быть ограничены степенью необходимости, чтобы не подвергать клетки излишнему стрессу.

• Круглая форма выращиваемых клеток: Это может быть вызвано вибрациями, поступающими из окружающей среды. Ваш инкубатор находится рядом со старым холодильником? Ваши коллеги регулярно хлопают дверьми? В соседней лаборатории идет ремонт?

• В центре лунки клетки не растут: Если объем жидкости в лунке слишком мал, мениск вытеснить клетки на край лунки. При тесном скоплении клеток связь между ними может быть нарушена, что приведет к замедлению или полному отсутствию роста. Достаточное количество культуральной среды поможет решить эту проблему.

• Микоплазмы: Бактерии, невидимые под световым микроскопом, могут серьезно нарушать или изменять рост и метаболизм ваших клеток. Из-за отсутствия клеточной стенки они устойчивы ко многим антибиотикам, используемым в лаборатории, таким как пенициллин, стрептамицин или гентамицин. Они также с легкостью проходят через стерильные фильтры с размером пор до 0,2 мкм. Регулярные проверки (например, с помощью тестов на основе ПЦР) обеспечивают уверенность, а соблюдение условий стерильности при работе снижает риск контаминации.

• Перекрестное загрязнение и подлинность: Является ли ваша клеточная линия тем, чем Вы ее считаете? Этот вопрос вполне оправдан, поскольку в лабораториях, где используются самые разные клеточные линии, происходит перекрестное заражение. Поэтому стоит внимательно изучить свою клеточную культуру до и после исследования.

Криоконсервация: правильное хранение клеточного материала

Откуда Вы обычно берете первичные клетки или клеточные линии? Вероятно, из морозильной камеры или — что еще лучше — из баллона с азотом. Криоконсервация является неотъемлемой частью клеточной биологии, поскольку многие клеточные линии нужны лишь на время для конкретных проектов.

Непрерывная культивация не имеет смысла по нескольким причинам. Время, материалы и место в инкубаторе лучше использовать для других целей. Кроме того, с каждым новым пассажем увеличивается риск того, что ваши клетки вступят в стадию старения или подвергнутся генетическим или морфологическим изменениям. При тщательном уходе и надлежащем хранении банк клеток также защищает вас от потери целых клеточных линий в случае контаминации, отказа оборудования или ошибок в обращении.

Хранение клеток: им (почти) никогда не бывает слишком холодно

Во многих лабораториях клетки — по крайней мере временно — хранятся в морозильной камере при сверхнизкой температуре до -80 °C. Эта температура, конечно, является достаточно низкой, однако она не подходит для длительного хранения ваших клеток. Это связано с тем, что образование внутриклеточного льда и рекристаллизация могут привести к быстрой потере жизнеспособности клетки.

Хранение клеток при <-130 °C в газовой фазе баллона азота убережет вас от этой проблемы, однако вам понадобится подходящий материал, способный выдерживать такие температуры. Ведь при температуре ниже -80 °C обычные пластиковые контейнеры из полипропилена или поликарбоната достигают пределов своих характеристик.

Подходящий материал обеспечит система замораживания CryoPure: пробирки, штативы и боксы, которые специально разработаны для таких температур.

Хладостойкость до <-196 °C: Пробирки, штативы и боксы CryoPure оптимизированы для использования в условиях экстремально низких температур

Эргономичность: Легкое открытие завинчивающейся крышки всего одним поворотом, удобное обращение благодаря специальной опорной ножке , цветовая маркировка с помощью цветных крышек и цветных кодирующих вставок

Фильтрация клеточных культур: все стерильно?

Автоклав и бокс микробиологической безопасности обеспечивают стерильность материалов и условий для работы с клеточными культурами. Разумеется, основной «дом» Ваших клеток — культуральная среда — также должен быть максимально стерильным. Однако стерилизация термолабильных компонентов в автоклаве не представляется возможной. Стерилизующая фильтрация позволяет безопасно удалять грибы, микоплазмы и другие бактерии.

Взвеси и более крупные частицы обычно можно удалить с помощью фильтра 0,45 мкм, но для бактерий и грибов следует использовать фильтр в 0,22 мкм. Если Вы хотите избежать заражения микоплазмой, лучше использовать фильтры с порами не более 0,1 мкм. Из-за отсутствия клеточной стенки маленькие вредители настолько пластичны, что легко проходят через фильтр с порами 0,2 мкм.

Уровни чистоты в при работе с культурами клеток: соблюдайте чистоту!

Время, деньги, энергия, преданность делу и терпимость к неудачам — необходимые условия для всех, кто работает в науке. Почти каждому исследователю знакомо это чувство, когда при первом взгляде в микроскоп становится ясно, что что-то пошло не так. Адгезивные клетки перемещаются в среде уже в мертвом виде, или же в ней растет что-то, что не должно расти.

Пробы и ошибки, успехи и неудачи — это такая же часть научной работы, как и пипетка в руке или микроскоп на столе. Однако ненужных неудач можно избежать, если с самого начала следить за степенью чистоты материалов для работы с клеточными культурами.

При этом важны различные факторы:

• Стерильность: гарантирует отсутствие жизнеспособных бактерий и грибков в вашей культуре.

• Отсутствие пирогенов / эндотоксинов: провоспалительные веществамогут оставаться на материале даже при отсутствии живых бактерий.

• Отсутствие цитотоксичности: для обеспечения роста клеток культура должна быть защищена от попадания цитотоксичных веществ.

• Отсутствие ДНК: сохраняет аутентичность вашей клеточной линии, поскольку при определенных условиях чужеродная ДНК из среды может быть поглощена клетками и интегрирована в геном.

• TC Tested: продукты с этой степенью чистоты не только отвечают вышеупомянутым требованиям, но и не содержат ДНКаз и РНКаз.

Узнайте более подробную информацию о наших степенях чистоты и КАЧЕСТВЕ SARSTEDT .