Hodowla komórkowa
Zoptymalizowane rozwiązania dla badań naukowych
Od ekspertów dla ekspertów
W naukach przyrodniczych obowiązuje podstawowa zasada: biologia komórkowa to nie wszystko, ale bez biologii komórkowej cała reszta utknie w martwym punkcie. Niemal każda, nawet najlepsza hipoteza naukowa musi zostać najpierw potwierdzona na poziomie najmniejszej jednostki, jaką jest komórka. Dlatego hodowla komórkowa jest niezbędna zarówno w badaniach podstawowych, jak i w rozwoju leków. Bez modeli komórkowych trudno dziś wyobrazić sobie badanie złożonych szlaków sygnałowych, odkrywanie i rozwój nowych leków, badania skuteczności i toksyczności, czy ograniczanie liczby doświadczeń na zwierzętach zgodnie z zasadą 3R (Replacement, Reduction, Refinement). Liczba dostępnych obecnie linii komórkowych i systemów hodowli jest ogromna: komórki pierwotne i wtórne oraz linie komórkowe, w zawiesinie lub hodowli adherentnej, hodowane w dwóch lub trzech wymiarach... A ponieważ właściwy wybór ma decydujące znaczenie dla powodzenia projektu badawczego, warto wiedzieć na co zwrócić uwagę.
Warto też pamiętać, że w przypadku pytań i wątpliwości możemy pomóc doprecyzować wymagania i dobrać najlepsze rozwiązanie z naszego portfolio, tym bardziej że dzięki wysokiej jakości naczyniom hodowlanym, bioreaktorom, systemom przechowywania i filtracji mamy odpowiednie narzędzia do praktycznie każdego projektu. Dlatego zapraszamy do poznania innowacyjnych rozwiązań firmy SARSTEDT i skorzystania ze specjalistycznej wiedzy naszych pracowników doskonale poruszających się w dziedzinie biologii komórkowej.
Komórki i linie komórkowe: trudny wybór
Pierwsze i często najważniejsze pytanie brzmi: która linia komórkowa najlepiej nadaje się do badań nad hipotezą badawczą? Do wyboru są komórki pierwotne i wtórne linie komórkowe.
Komórki pierwotne izoluje się bezpośrednio z tkanek lub płynów ustrojowych człowieka bądź zwierząt. Zazwyczaj lepiej odzwierciedlają rzeczywiste właściwości morfologiczne oraz fizjologiczne tkanki, z której pochodzą i dlatego wyniki uzyskiwane przy ich pomocy dostarczają bardziej miarodajnych rezultatów niż wtórne linie komórkowe. Jednak żywotność i zdolność proliferacji komórek pierwotnych są ograniczone, komórki dzielą się wolniej, a sama hodowla jest bardziej czasochłonna i wymagająca.
Wtórne linie komórkowe, takie jak HeLa, HEK‑293 czy komórki CHO, mają nieograniczoną zdolność do podziału i przeżycia (są unieśmiertelnione). Łatwo je prowadzić według dobrze opisanych protokołów, dzielą się szybciej i są powszechnie dostępne w stosunkowo niskiej cenie. Nie odwzorowują jednak tak wiernie fizjologii tkanki wyjściowej jak komórki pierwotne.
Po dokonaniu wyboru komórek lub linii komórkowych odpowiednich do danego projektu badawczego warto zwrócić uwagę na kilka istotnych kwestii:`
Autentyczność: czy na pewno pracujesz z właściwą linią lub typem komórek?
Zanieczyszczenie: czy hodowla jest wolna od mykoplazm, wirusów, drożdżaków oraz zanieczyszczeń pochodzących z innych komórek?
Niska liczba pasażów: unieśmiertelnione linie komórkowe, zwłaszcza nowotworowe, często wykazują dużą niestabilność genetyczną i mogą ulegać zmianom w kolejnych pasażach. Dlatego liczba pasaży powinna być możliwie niska.
Warunki hodowli: wszystko musi się zgadzać
Niezależnie od tego, czy używane są komórki pierwotne, czy wtórne linie komórkowe, o powodzeniu hodowli decydują właściwe warunki. Zaczyna się to od wyboru optymalnej powierzchni wzrostowej we właściwym naczyniu hodowlanym.
Komórki adherentne mają zupełnie inne wymagania niż komórki utrzymywane w zawiesinie:
Hydrofilowe naczynia hodowlane zapewniają optymalne podłoże dla komórek adherentnych, ułatwiają ich początkową adsorpcję, a następnie trwałą adhezję do powierzchni.
Hydrofilowe naczynia hodowlane z dodatkowymi grupami polarnymi wspomagają adsorpcję i adhezję szczególnie wymagających komórek pierwotnych oraz wrażliwych linii komórkowych.
Hydrofobowe naczynia hodowlane ograniczają adhezję komórek zawiesinowych i utrzymują je w roztworze.
W przypadku komórek adhezyjnych powierzchnia naczynia hodowlanego musi być możliwie idealnie płaska. Dzięki temu komórki mogą tworzyć równomierną warstwę, zamiast gromadzić się przy brzegach.
W zależności od zastosowania dostępne są różne typy naczyń hodowlanych:
Butelki hodowlane (flaski): do hodowli dużej liczby komórek, z dobrą ochroną przed zanieczyszczeniem dzięki nakrętce.
Szalki hodowlane: do hodowli niewielkiej liczby komórek.
Płytki wielodołkowe: do hodowli małej liczby komórek, np. w przypadku badań równoległych.
Oprócz odpowiedniego naczynia hodowlanego decydującą rolę odgrywają również pożywki hodowlane, czynniki środowiskowe oraz, nie ma co ukrywać, czynnik ludzki.
Hodowla 3D: wszystko kręci się w trzech wymiarach
Klasyczne hodowle komórkowe 2D dobrze sprawdzają się w przypadku wielu podstawowych zagadnień badawczych. Jednak wyniki uzyskane z pojedynczej warstwy identycznych komórek tylko w ograniczonym stopniu da się przełożyć na rzeczywistą tkankę, nie mówiąc już o całym narządzie czy organizmie.
Z tego względu coraz ważniejszą rolę odgrywają sferoidy komórkowe, ponieważ:
Tworzą kontakty komórka–komórka oraz komórka–macierz zewnątrzkomórkowa.
Mogą składać się z różnych typów komórek.
Ich trójwymiarowa struktura zapewnia gradienty składników odżywczych, tlenu i substancji czynnych.
Zmniejszają dystans pomiędzy in vitro i in vivo.
Mogą przyczynić się do ograniczenia liczby doświadczeń na zwierzętach.
BIOFLOAT™: szybka i powtarzalna hodowla kultur sferoidalnych
Byłoby idealnie, gdyby sferoidy o jednorodnym kształcie i wielkości powstawały szybko i w powtarzalny sposób, nawet w przypadku wymagających linii komórkowych. Odpowiednia płytka do hodowli komórkowej może to zadanie znacząco ułatwić i zapewnić mierzalnie lepsze wyniki.
Wysoce antyadhezyjna, odporna powierzchnia BIOFLOAT™ działa jak powłoka nieprzywierająca i sprawia, że komórki adherentne preferencyjnie tworzą kontakty między sobą, zamiast przywierać do podłoża. W porównaniu z innymi powierzchniami antyadhezyjnymi oznacza to dla hodowli 3D:
Szybsze tworzenie sferoidów: zwykle w ciągu 2–24 godzin, w zależności od linii komórkowej.
Wyższą powtarzalność dzięki bardzo jednorodnym, kulistym sferoidom.
Wiarygodne tworzenie sferoidów, nawet w przypadku wymagających linii komórkowych.
96‑dołkowe płytki do hodowli komórkowej BIOFLOAT™, o wymiarach zgodnych ze standardem ANSI/SLAS, doskonale nadają się do zautomatyzowanych procedur wysokoprzepustowych, m.in. w fazie przedklinicznej badań nad lekami, w toksykologii lub w badaniach nad rakiem.
Polecane produkty
Wkładki TC do złożonych eksperymentów w hodowli komórek i tkanek
Oprócz hodowli sferoidów warunki zbliżone do in vivo można odwzorować także wykorzystując płytki hodowlane z odpowiednimi wkładkami TC:
układ dwukomorowy zapewnia komórkom środowisko zbliżone do warunków in vivo.
wkładki wyposażone są w ultracienką, mikroporowatą błonę, która umożliwia optymalną adhezję komórek.
System dwukomorowy umożliwia przeprowadzanie złożonych eksperymentów, np. badań transportu, sekrecji i dyfuzji, hodowli współistniejących, hodowli komórek 3D, jak w przypadku organotypowych modeli skóry i innych.
Komórki w centrum uwagi: produkty do mikroskopii komórkowej
Gołym okiem na dnie naczynia hodowlanego widać zwykle tylko mleczny nalot i lekko zmętnioną pożywkę. Komórki ssaków mają średnicę ok. 1–30 µm, a przeciętna komórka ludzka ok. 25 µm, dlatego stan i wzrost hodowli komórkowej można realnie ocenić jedynie za pomocą mikroskopu. Dalsze szczegóły, np. określone organelle, cząsteczki powierzchniowe lub ekspresja określonych produktów genowych stają się widoczne po odpowiednim barwieniu lub znakowaniu z użyciem np. technik mikroskopii fluorescencyjnej.
Fabryka komórek: bioreaktor miniPERM®
Efektywna produkcja biomasy lub produktów komórkowych, takich jak białka, w większych ilościach jest trudna w klasycznych butelkach hodowlanych, ponieważ wymaga jednoczesnego prowadzenia wielu równoległych hodowli i zajmuje dużo miejsca w inkubatorze.
Zdecydowanie lepszym rozwiązaniem jest zastosowanie bioreaktora, który stale dostarcza komórkom składniki odżywcze, usuwa produkty przemiany materii i pozwala uzyskać możliwie najwyższą wydajność.
W skali laboratoryjnej oprócz wysokiej wydajności liczy się także prosta, wygodna obsługa. I właśnie dlatego produkcja w bioreaktorze miniPERM® jest rozwiązaniem idealnym.
Przemyślana konstrukcja: moduł pożywkowy o objętości ok. 400 ml jest oddzielony od modułu produkcyjnego (35 lub 50 ml) membraną dializacyjną, która zapewnia efektywne zaopatrzenie komórek w składniki odżywcze, podczas gdy produkt o masie < 12,5 kDa pozostaje w module produkcyjnym.
Wysoka gęstość komórek: możliwe są gęstości dochodzące do 1x107 komórek/ml, co odpowiada około 20 dużym butelkom hodowlanym lub trzem 1-litrowym butelkom typu "roller".
Optymalna wymiana gazowa: zewnętrzna powierzchnia modułu produkcyjnego wykonana jest z membrany silikonowej przepuszczalnej dla O2 i CO2.
Wszechstronność: w miniPERM® można hodować wiele typów komórek pochodzących od ssaków, roślin i owadów.
Oszczędność miejsca i prostota: dzięki uniwersalnemu urządzeniu obrotowemu w jednym inkubatorze można umieścić nawet cztery bioreaktory, co pozwala oszczędzić miejsce i czas.
Polecane produkty
Rozwiązywanie problemów: jak uniknąć typowych pułapek
Problemy w hodowli komórkowej potrafią pojawić się pomimo doświadczenia i zachowania staranności. Oto kilka typowych sytuacji i sposoby, jak im zapobiegać:
Pipetowanie: zbyt gwałtowne pipetowanie powoduje silne naprężenia mechaniczne, a w skrajnym przypadku może prowadzić do uszkodzenia komórek pod wpływem sił ścinających. Przy wymianie pożywki nie należy dotykać końcówką pipety dna naczynia, aby nie uszkodzić warstwy komórek.
Wirówka: komórki należy wirować tylko tak długo i z taką prędkością, jaka jest konieczna, aby ograniczyć stres mechaniczny.
Okrężnywzrost komórek: jeśli komórki rosną w pierścieniu przy brzegach, przyczyną mogą być drgania w otoczeniu inkubatora, np. stojąca obok stara lodówka, trzaskanie drzwiami lub prace remontowe w sąsiednim pomieszczeniu.
Brak wzrostu w centrum dołka: menisk powstający przy zbyt małej objętości pożywki może "wypychać" komórki ku brzegowi dołka, gdzie gromadzą się w dużym zagęszczeniu. Sprzyja to zahamowaniu wzrostu na skutek kontaktowej inhibicji. Pomocne jest wówczas dodanie odpowiedniej ilości pożywki hodowlanej.
Mykoplazmy: te niewidoczne w mikroskopie świetlnym bakterie mogą mieć znaczący wpływ na wzrost i metabolizm komórek. Ze względu na brak sztywnej ściany komórkowej są oporne na wiele rutynowo stosowanych antybiotyków (np. penicylinę, streptomycynę, gentamycynę) i bez problemu przechodzą przez filtry o porach 0,2 µm. Ryzyko kontaminacji można ograniczyć wykonując regularnie testy, np. oparte na PCR, i zapewniając sterylne warunki pracy.
Zanieczyszczenia krzyżowe i autentyczność: czy używana linia komórkowa na pewno jest tą, która miała być badana? W laboratoriach pracujących na wielu liniach jednocześnie zdarzają się zanieczyszczenia obcymi komórkami. Dlatego przed rozpoczęciem i po zakończeniu projektu warto dokładnie przyjrzeć się własnej hodowli komórkowej.
Prawidłowe przechowywanie materiałów komórkowych: kriokonserwacja
Skąd zazwyczaj pozyskiwane są komórki pierwotne lub linie komórkowe? Prawdopodobnie z zamrażarki niskotemperaturowej lub ze zbiornika, albo z ciekłego azotu. Kriokonserwacja jest bardzo ważna w biologii komórkowej, ponieważ wiele linii wykorzystywanych jest jedynie okresowo, w konkretnych projektach.
Ciągła hodowla "w nieskończoność" nie ma sensu z wielu powodów, takich jak: czas, materiały i miejsce w inkubatorach, które przecież można lepiej wykorzystać. Ponadto z każdym kolejnym pasażowaniem rośnie ryzyko wejścia komórek w senescencję oraz wystąpienia zmian genetycznych lub morfologicznych. Starannie utrzymywany i przechowywany bank komórek chroni również przed utratą całych linii komórkowych w wyniku zanieczyszczenia, awarii sprzętu lub błędów obsługi.
Przechowywanie komórek: nie ma czegoś takiego jak zbyt niska temperatura
W wielu laboratoriach komórki przechowuje się, czasami przejściowo, w zamrażarkach niskotemperaturowych w temperaturze około -80 °C. Wydaje się to dość niską temperaturą, ale jednak nie nadaje się do długotrwałego przechowywania komórek, ponieważ powstawanie i przebudowa kryształów lodu wewnątrz komórek szybko obniża ich przeżywalność.
Bezpieczną procedurą jest przechowywanie komórek w temperaturze poniżej −130 °C (np. w fazie gazowej ciekłego azotu). Niezbędne są jednak do tego materiały eksploatacyjne dostosowane do tak ekstremalnych warunków. Na przykład typowe probówki z polipropylenu czy poliwęglanu mogą ulegać uszkodzeniom w temperaturze poniżej −80 °C.
Kompletnym rozwiązaniem jest system CryoPure firmy SARSTEDT oferujący probówki, stojaki i pudełka zaprojektowane specjalnie do pracy w bardzo niskich temperaturach.
Odporność na niskie temperatury do wartości poniżej -196 °C: Probówki, stojaki i pojemniki CryoPure są zoptymalizowane pod kątem przechowywania w ekstremalnie niskich temperaturach.
Ergonomia: łatwe otwieranie zakrętki jednym obrotem, wygodna obsługa dzięki specjalnie zaprojektowanemu dnu probówki, czytelne kodowanie kolorami (zakrętki, wkładki kodujące) ułatwiające identyfikację próbek.
Polecane produkty
Filtracja w hodowli komórkowej: czy wszystko jest sterylne?
Sterylność materiałów i warunków pracy podczas pracy z hodowlami komórkowymi zapewniają autoklaw i komora bezpieczeństwa. Jednak jak najczystsza powinna być także pożywka hodowlana. W przypadku składników wrażliwych na wysoką temperaturę sterylizacja w autoklawie nie jest możliwa, natomiast sterylna filtracja pozwala bezpiecznie usuwać grzyby, mykoplazmy i inne bakterie.
Zawiesiny i większe cząstki można zwykle usunąć stosując filtr o porach 0,45 µm, natomiast do zatrzymywania bakterii i grzybów zaleca się filtry o porach 0,22 µm. Aby realnie zabezpieczyć się także przed mykoplazmami, optymalnym wyborem jest filtr o porowatości 0,1 µm, ponieważ ze względu na niewielki rozmiar i brak sztywnej ściany komórkowej mykoplazmy są na tyle "plastyczne", że mogą przechodzić przez membrany o nominalnej wielkości porów 0,2 µm.
Polecane produkty
Poziomy czystości w hodowli komórkowej: utrzymaj kulturę w czystości!
Nauka wymaga czasu, pieniędzy, energii, zaangażowania i sporej dawki cierpliwości. A jednak niemal każdy badacz zna to uczucie, kiedy już po pierwszym spojrzeniu w mikroskop widzi, że coś jest nie tak: komórki, które miały przyrastać jako warstwa adherentna, pływają martwe w pożywce, albo w kolbie rośnie coś, co rosnąć tam nie powinno.
Metoda prób i błędów, sukcesy i potknięcia są integralną częścią pracy naukowej, tak samo jak pipeta w dłoni czy mikroskop na stole. Niepotrzebne niepowodzenia można jednak ograniczyć, jeśli od początku zwróci się uwagę na poziom czystości materiałów używanych w hodowli komórkowej.
Ważną rolę odgrywa tu kilka parametrów:
Sterylność: gwarantuje, że do hodowli nie zostaną wprowadzone żywe bakterie ani grzyby.
Brak pirogenów i endotoksyn: substancje prozapalne mogą pozostawać na materiale nawet po usunięciu żywych bakterii.
Brak substancji cytotoksycznych: aby zapewnić prawidłowy wzrost komórek, do hodowli nie mogą dostać się żadne substancje cytotoksyczne.
Brak DNA: zachowanie autentyczności linii komórkowej wymaga wyeliminowania obcego DNA, które w sprzyjających warunkach mogłoby zostać pobrane z otoczenia i zintegrowane z genomem komórki.
Testowane pod kątem TC: produkty o tym poziomie czystości spełniają wszystkie powyższe kryteria, a dodatkowo są wolne od DNazy i RNazy.
Przegląd dostępnych poziomów czystości oraz szczegółów koncepcji SARSTEDT QUALITY można znaleźć w materiałach poświęconych klasom czystości produktów.
Life is not always science.
But science is our Life.
W SARSTEDT pracujemy w myśl zasady: przekonuj do siebie jakością, twórz trwałe relacje z klientami dzięki doskonałej obsłudze. Niezawodność i doświadczenie, innowacyjność i dynamizm. SARSTEDT bazuje na sprawdzonych i niezawodnych wartościach, łącząc je z dynamicznymi procesami oraz partnerskim podejściem i działaniem.
