細胞培養に焦点を当てる

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生命科学の分野では：細胞生物学がすべてではありませんが、細胞生物学がなければ何もはじまりません。

。ほとんどすべての科学的仮説は、どんなに優れたものであっても、まず生命の最小単位である細胞においてその妥当性を証明しなければならないからです。そのため、細胞培養は基礎研究や薬剤研究において欠かすことができません。複雑なシグナル伝達経路の解明、医薬品開発、有効性・毒性試験、あるいは3Rルールに沿った動物実験の削減は、細胞モデルなしでは実現することができません。現在、利用できる細胞株や培養システムの種類はいまや膨大なものとなっています。初代細胞、二次細胞株、もしくは細胞株、浮遊 または接着性、二次元または三次元培養など、研究の成功のためには正しい選択が必要です。ではどのような考慮をする必要があるでしょうか。

SARSTEDTなら、このような疑問に対して、信頼できるパートナーがそばにいます。私たちの経験豊富なエキスパートが、お客様の具体的なご要望をお伺いし、私たちの豊富なポートフォリオの中から最適なソリューションをご提案します。高品質の培養容器、バイオリアクター、貯蔵・ろ過システムで、あらゆる作業に最適なツールをご用意しています。当社の革新的なソリューションをご覧いただき、細胞生物学の専門知識をご活用ください。

細胞と細胞株：選択の悩み

最初にして、そして最も重要な課題は多くの場合次のようなものです：要検討

• 初代細胞は、ヒトや動物の組織、あるいは体液から直接単離されます。それは、採取された組織の形態学的・生理学的特徴を正確に反映するため、二次細胞株よりも有意義な結果をもたらします。しかし、寿命と増殖には限りがあり、時間がかかります。培養はしばしばより時間と経費がかかり、複雑です。

• 一方、HeLa細胞、HEK-293細胞、CHO細胞などの二次細胞株は、無制限に分裂と生存が可能です（不死化）。それらは確立されたプロトコルで簡単に培養でき、分裂も早く、比較的安価で市販されています。しかし、これらの細胞は、初代細胞に比べ、元の組織の生理的特性を正確に再現することができません。

研究課題に適した細胞や細胞株を選んだら、いくつかの点をチェックする必要があります。

• 信憑性：正しい細胞株や細胞タイプが実際に存在するか？

• コンタミネーション：培養物にマイコプラズマ、ウイルス、酵母、あるいは他の細胞からのクロスコンタミネーションがないか？

• 低継代：腫瘍細胞などの不死化細胞株は、遺伝的不安定性が高く、頻繁に継代すると変性することが多い。つまり、継代数は低いのか？

培養条件：すべてのことを正しく

初代細胞、二次細胞株のいずれを扱うにせよ、特定の培養条件が決定的な役割を果たします。それは 最適な培養容器 の選択から始まります。

表面に接着する細胞は、懸濁液中で培養される細胞とは異なる条件が必要です。

• 親水性の培養容器は、多くの接着性の細胞に最適な培養基盤を提供し、初期吸着およびその後の接着を促進します。

• 極性基を付加した親水性培養容器は、初代細胞や感受性の高い細胞株の吸着と接着を促進します。

• 一方、疎水性培養容器は、浮遊細胞の容器への接着を低下させ、細胞を溶液中に保持します。

特に接着性の細胞の場合、培養容器の表面は、細胞が均一な細胞層を形成し、縁に沈殿しないように、均一でフラットな表面でなければなりません。

用途に応じて、このためにさまざまな培養容器が利用可能です。

• フラスコ：細胞数が多い場合、スクリューキャップにより汚染からの保護が高い

• ディッシュ：中間のの細胞数用

• プレート：並行実験などや、細胞数が少ない場合

適切な培養容器に加え、培養液、周囲の要因や人的要因も決定的な役割を果たします。

三次元細胞培養：Nice and round

古典的な二次元細胞培養は、多くの基礎的な研究課題に適しています。しかし、同一細胞の単一層から得られる結果を、組織、ましてや器官、さらには生物全体へと転用できるのは、ごく限られた範囲でしかありません。

生体の複雑さにできるだけ近づくために、スフェロイド培養は生命科学研究においてますます重要な役割を果たしています。なぜなら：

• それは細胞-細胞間、細胞-マトリックス間の接触を形成するからです。

• また、異なるタイプの細胞で構成されることができます。

• その三次元構造は、栄養、酸素、有効成分の勾配をもたらします。

• したがって、それはIn vitro と in vivoのギャップを埋めます。

• 動物実験を減らすことに貢献することもできます。

BIOFLOAT^TM:迅速で再現性の高いスフェロイド培養

たとえ要求の高い細胞株に関しても、理想的には、均一なスフェロイドを迅速かつ再現性よく生成することができます。適切な細胞培養プレートを使用することで、作業が格段に容易になり、測定可能なより良い結果が得られます。

BIOFLOAT™は、その安定で接着防止効果の高い表面により、接着細胞が優先的に細胞間コンタクトを形成させることができます。他の接着防止表面と比較して：細胞株によって異なりますが、すでに2～24時間後のより迅速なスフェロイド形成

• 均一なスフェロイドによる高い再現性

• 要求の厳しい細胞株でも信頼性の高いスフェロイド形成

ANSI/SLAS標準寸法の96ウェル細胞培養プレートとしてBIOFLOATTM は、薬剤研究の前臨床段階、毒性学的研究、癌研究などの自動化されたハイスループット手順に適しています。

TCインサート 細胞培養や組織培養でのよ り高度な実験に

スフェロイド培養に加え、細胞培養プレートとそれに対応するTCインサートを使用することで、in vivo条件をシミュレートすることもできます：

• 2コンパートメントシステムは、細胞にIn vivoに近い環境を提供します。

• このインサートは、最適な細胞接着を可能にする超薄型多孔膜を有します。

2コンパートメントシステムにより、輸送、分泌、拡散研究、共培養、器官型皮膚モデルのような三次元細胞培養など、複雑な実験を行うことができます。

細胞に焦点を当てる：細胞の顕微鏡観察のための製品

培養容器の底には乳白色の膜、懸濁培養液には濁ったきらめきがあり、肉眼ではそれ以上何も見えません。哺乳類の細胞の大きさは1～30μm、ヒトの細胞は平均25μm程度です。細胞培養の状態や増殖は、光学顕微鏡でしか評価できません。更なる詳細、たとえば特定のオルガネラ、表面分子、特定の遺伝子産物の発現などは、適切な染色や標識の後、蛍光顕微鏡などを使うことで明らかにすることができます。

細胞の生産工場：miniPERM^®バイオリアクター

バイオマスやタンパク質のような細胞産物を効率よく大量に生産することは、従来の培養フラスコでは難しいです。多くの重労働に加え、インキュベーターに必要なスペースも必要だからです。

その代わりに、細胞に常に培地を供給し、代謝廃棄物を除去し、可能な限り高い収量を確保するバイオリアクターを使用することができます。

実験室規模では、収率が高いだけでなく、取り扱いが簡単であることが求められます。miniPERM®バイオリアクター の中での生産がそのために理想的です。

• 最適化されたデザイン：35mlまたは50mlの培養モジュールと400mlの培地モジュールは透析膜によって分離されており、培養産物（<12.5kD）は培養モジュールの中に残ります。

• 細胞密度が高い：1x10⁷細胞 /mlまで可能で、これは大型培養ボトル約20本分、または1リットルローラーボトル3本分に相当します。

• 最適なガス交換：培養モジュールの外側は、酸素と二酸化炭素を透過するシリコーン膜で構成されています。

• 多面的：様々な哺乳類、植物、昆虫の細胞を培養することができます。

トラブルシューティング：このようなつまずき石を避けることができる

細心の注意と経験に関わらず、トラブルの原因は時として細部に潜んでいます。

典型的な問題とその回避方法。

• ピペッティング：急激なピペッティングは細胞にストレスを与え、最悪の場合、細胞はせん断力によって破壊されてしまう可能性があります。培地交換の際、細胞層を傷つけないよう、ピペットチップが培養容器の底に触れないようにすべきです。

• 遠心分離：細胞に不必要なストレスを与えないよう、遠心分離は必要最低限の時間と速度で行ってください。

• 同心円状の細胞成長：その原因は周囲の振動である可能性があります。インキュベーターは古い冷蔵庫の横にありますか？あなたの同僚は定期的にドアをバタンと閉めますか？隣の実験室は改装中ですか？

• ウェルの中心部で成長がない：ウェル内の液量が少なすぎると、メニスカスが細胞をウェルの縁に押しやる可能性があります。そこに細胞が高密度で蓄積すると、接触阻害が起こり、成長が低下するか、まったくしなくなる可能性があります。十分な量の培地が対策になります。

• マイコプラズマ：光の顕微鏡では見えない細菌が、細胞の成長や代謝を著しく損なったり、変化させたりすることがあります。細胞壁を持たないため、それらはペニシリン、ストレプタマイシン、ゲンタマイシンなど、実験室で使用される多くの抗生物質に対して耐性があります。また、それらは孔径0.2μmまでの滅菌フィルターも問題なく通過します。PCR法を用いた検査など、定期的なチェックは確実性をもたらし、無菌的な作業方法はリスクを軽減します。

• クロスコンタミネーションと真正性：あなたの細胞株は、あなたが思っているようなものですか？様々な細胞株を扱うラボではクロスコンタミネーションが起こることがあるので、プロジェクトの前後には自分の細胞をよく観察する必要があります。

細胞材料 を正しく保管する：凍結保存

通常、初代細胞や 細胞株はどこから入手するのでしょうか。おそらく冷凍庫か、あるいは更に良いのは窒素タンクからでしょう。多くの細胞株は特定のプロジェクトのために 一時的にしか必要とされないため、凍結保存は細胞生物学にとって不可欠な要素です。

時間、マテリアル、インキュベーター内のスペースは、他の目的に使った方が良いでしょう。加えて、継代を重ねるごとに、細胞が老化したり、遺伝的・形態的変化を起こしたりするリスクが高まります。しっかり管理された保管システムは、コンタミネー ション、装置の故障、取り扱いミスによる細胞株の損失からも守ってくれるでしょう。

細胞の保存：低温すぎるということはない

多くのラボでは、細胞は-80℃前後の超低温冷蔵庫に保管されます。

これはかなりの低温でありますが、細胞の永久保存には適しません。細胞内に氷が形成され、再結晶化することで、 生存能力が急速に失われる可能性があるからです。

窒素タンクの気相中で-130 °Cで保存すれば安心ですが、従来のポリプロピレンやポリカーボネート容器では-80 ℃を超えると限界に達するため、この低温に耐えうる適切なチューブを選ぶ必要があります。

CryoPureシステムは特別に設計された器材で細胞の凍結保存をサポートします。

耐冷温度<-196 °C:CryoPure のチューブ、ラック、ボックスは極低温用に最適化されています。

エルゴノミック：スクリューキャップを1回転させるだけで簡単に開けられ、専用のチューブラックにより片手でチューブの開閉ができ、カラーキャップとカラーコードインサートによりサンプルの管理も簡便になります。

細胞培養における濾過：すべてのものを無菌に

オートクレーブと安全キャビネットは、細胞培養プロセス中の無菌操作を保証します。もちろん、細胞の命の源である培地も可能な限り無菌でなければなりません。しかし、オートクレーブでの滅菌は熱に不安定な成分を含む培地では行えませんが、無菌ろ過を使えば真菌、マイコプラズマ、その他のバクテリアを安全に除去することができます。

浮遊物質や大きな粒子は通常0.45μmのフィルターで除去できますが、細菌や真菌には0.22μmのフィルターを使用する必要があります。マイコプラズマは細胞壁がないため非常に柔順で、0.2 µmのフィルターを簡単に通過することができるため、安全に処理したい場合は孔径0.1 µmのフィルターを使用するのがベストです。

細胞培養における清浄度：Keep it clean!

時間、お金、エネルギー、情熱、そして多くのフラストレーション耐性--科学に携わる者は通常、これらすべてを持っていかなければなりません。ほとんどすべての研究者がその気持ちを知っています：顕微鏡で一目見ただけでも、何かが間違っているのは明らかです。実際に付着している細胞は、培地中を漂って死んでしまうか、そこで育つはずのない何かが育ちます。

試行錯誤、成功と失敗は、手にしたピペットやテーブルの上の顕微鏡と同じように、科学的な仕事の一部です。しかし、最初から細胞培養に使用する材料の純度に注意を払うことで、不必要な後退を避けることができます。

ここにはさまざまな要因が絡んでいます：

• 無菌状態：生菌や真菌が培養液に混入しないことを保証します。

• パイロジェンフリー/エンドトキシンフリー：炎症促進物質は、たとえ生きた細菌存在しなくても基材上に残っている可能性があります。

• 非細胞毒性：細胞増殖を確実にするため、細胞毒性物質が培養液に混入してはなりません。

• DNAフリー：ある条件下では、培地中の外来DNAが細胞に取り込まれ、ゲノムに組み込まれる可能性があるため、細胞株の信憑性を保つことができます。

• TC-tested：この純度の製品は、上記の要件を満たすだけでなく、DNaseおよびRNaseフリーです。

当社の清浄度レベルとSARSTEDTクオリティ の概要をご覧ください。