Par des experts pour des experts

Dans les sciences de la vie, la biologie cellulaire n’est pas tout, mais sans biologie cellulaire, nous ne faisons rien. En effet, presque toutes les hypothèses scientifiques, aussi bonnes soient-elles, doivent d’abord prouver leur exactitude dans la plus petite unité de vie, la cellule. C’est pourquoi nous ne pouvons plus remettre en question la culture cellulaire dans la recherche fondamentale et pharmaceutique. L’élucidation de voies de signalisation complexes, le développement de médicaments, les études d’efficacité et de toxicité ou la réduction de l’expérimentation sur les animaux suivant la règle des 3R est difficilement envisageable sans modèles cellulaires. La diversité des lignées cellulaires disponibles et des systèmes de culture est désormais démesuré. Cellules ou lignées cellulaires primaires et secondaires, en suspension ou adhérentes, cultivées en deux ou trois dimensions ? Le bon choix est décisif pour la réussite de votre travail scientifique. À quoi faut-il faire attention ?

Pour toutes ces questions, vous avez avec SARSTEDT un partenaire fiable à vos côtés. En collaboration avec vous, nos experts expérimentés identifient vos exigences spécifiques et composent la solution optimale à partir de notre vaste portfolio. Avec nos récipients de culture, nos bioréacteurs, nos systèmes de stockage et de filtration de haute qualité, nous avons les outils adéquats pour toutes vos tâches. Découvrez nos solutions innovantes et profitez de notre expertise en biologie cellulaire.

Cellules et lignées cellulaires : vous avez le choix

La première question, et la plus importante, est souvent la suivante: Quelle lignée cellulaire convient le mieux à votre problématique ? Pour ce faire, des cellules primaires et des lignées cellulaires secondaires entrent en ligne de compte.

• Les cellules primaires sont isolées directement à partir de tissus humains ou animaux ou de liquides biologiques. Elles fournissent des résultats plus pertinents que les lignées cellulaires secondaires, car elles reproduisent fidèlement les caractéristiques morphologiques et physiologiques des tissus dans lesquels elles ont été prélevées. Pourtant, leur durée de vie et leur prolifération sont limitées et lentes. Leurs mises en cultures est souvent plus coûteuses et plus complexes.

• En revanche, les lignées cellulaires secondaires telles que les cellules HeLa, HEK-293 ou CHO sont capables de se diviser et de survivre indéfiniment (immortalisées). Elles sont faciles à cultiver selon des protocoles établis. Elles se divisent plus rapidement et sont disponibles dans le commerce à un prix abordable. Cependant, elles reproduisent les propriétés physiologiques du tissu d’origine nettement moins précisément que les cellules primaires.

Une fois que vous avez choisi les cellules ou les lignées cellulaires adaptées à votre sujet de recherche, il est important de vérifier certains points :

• L’authenticité : s’agit-il vraiment de la bonne lignée cellulaire ou du bon type de cellules ?

• Contamination : la culture est-elle exempte de mycoplasmes, de virus, de levures ou de contaminations croisées par d’autres cellules ?

• Peu de passage : les lignées cellulaires immortalisées, par exemple les cellules tumorales, présentent souvent une grande instabilité génétique et peuvent dégénérer après des passages fréquent – le nombre de passages est-il donc faible ?

Conditions de culture : tout doit être en ordre !

Que vous travailliez avec des cellules primaires ou des lignées cellulaires secondaires, les conditions de culture spécifiques jouent un rôle crucial. Cela commence déjà par le choix d’un support de culture adapté.

Les cellules, qui adhèrent aux surfaces, ont des besoins différents des cellules cultivées en suspension :

• Les supports de culture hydrophiles offrent aux cellules adhérentes un substrat de culture optimal. Ils facilitent l’adsorption initiale et l’adhésion ultérieure des cellules.

• Les supports de culture hydrophiles avec des groupes polaires supplémentaires facilitent l’adsorption et l’adhésion des cellules primaires ou des lignées cellulaires sensibles.

• En revanche, les supports de culture hydrophobes réduisent l’adhésiondes cellules en suspension et les maintiennent en solution.

La surface du contenant de culture doit être absolument plane, notamment pour les cellules adhérentes, afin que vos cellules forment un tapis cellulaire uniforme et ne se déposent pas sur les bords.

Selon l’application, vous disposez à cet effet de différents contenants de culture :

• Flacons : pour un nombre élevé de cellules, protection élevée contre les contaminations grâce au bouchon à vis

• Boîtes : pour un nombre moyen de cellules

• Plaques : pour les petits nombres de cellules, par exemple pour la réalisation d’essais en parallèle

Outre le contenant et support de culture appropriés, les milieux de culture, les facteurs environnementaux et le facteur humain jouent un rôle décisif.

Culture cellulaire tridimensionnelle : ça tourne rond !

Pour de nombreux projets de recherche fondamentales, les cultures cellulaires bidimensionnelles classiques conviennent. Or, les résultats d’un tapis cellulaire monocouche de cellules identiques ne peuvent être transposés que de manière très limitée à des tissus, et encore moins à un organe ou même à un organisme entier.

Pour se rapprocher le plus possible de cette complexité, les cultures de sphéroïdes jouent un rôle de plus en plus important dans la recherche en sciences de la vie. En effet :

• Elles forment des contacts cellule-cellule et cellule-matrice.

• Elles peuvent être composées de différents types cellulaires.

• Leur structure 3D assure des gradients de nutriments, d’oxygène ou de substances actives.

• Elles comblent la lacune entre la situation in vitro et la réalité in vivo.

• Elles peuvent contribuer à réduire l’expérimentation animale.

BIOFLOAT^TM : culture de sphéroïdes rapide et reproductible

Idéalement, il est possible de produire des sphéroïdes uniformes de manière rapide et reproductible, même lorsqu’il s’agit de lignées cellulaires exigeantes. Une plaque de culture cellulaire adaptée peut vous faciliter considérablement la tâche et vous permettre d’obtenir des résultats mesurables.

Grâce à sa surface robuste et hautement anti-adhérente, BIOFLOAT^TM garantit que les cellules adhérentes établissent de préférence des contacts cellule-cellule. Par rapport à d’autres surfaces anti-adhésives, cela signifie pour votre culture 3D :

• Formation plus rapide des sphéroïdes après seulement 2 à 24 heures, selon la lignée cellulaire

• Meilleure reproductibilité grâce à des sphéroïdes ronds très réguliers

• Formation fiable de sphéroïdes, même avec des lignées cellulaires exigeantes

En tant que plaque de culture cellulaire à 96 puits, de dimensions standard ANSI/SLAS[BS1] , BIOFLOAT^TM , elle convient, grâce à ces caractéristiques, aux procédés automatisés à haut débit (phase préclinique de la recherche sur les médicaments, études toxicologiques, recherche sur le cancer ).

Inserts TC pour des expériences complexes en culture cellulaire et tissulaire

Outre la culture de sphéroïdes, il est également possible de créer des conditions in vivo en utilisant des plaques de culture cellulaire et des inserts TC correspondants :

• Le système à 2 compartiments offre à vos cellules un environnement similaire à la situation in vivo.

• Les inserts sont dotés d’une membrane microporeuse ultrafine qui permet une adhésion optimale des cellules.

Le système à 2 compartiments vous permet de réaliser des expériences complexes, par exemple des études de transport, de sécrétion et de diffusion, des co-cultures, des cultures cellulaires 3D comme des modèles de peau organotypiques entre autres.

Priorité mise sur les cellules : produits pour la microscopie cellulaire

Un film laiteux au fond du support de culture, une lueur trouble dans le milieu de culture en suspension… C’est tout ce que nous pouvons voir à l’œil nu. Les cellules de mammifères mesurent entre 1 et 30 µm, les cellules humaines en moyenne environ 25 µm. L’état ou la croissance de votre culture cellulaire ne peuvent ainsi être évalués que par microscopie optique. D’autres détails, par exemple des organelles spécifiques, des molécules de surface ou l’expression de certains produits génétiques, sont révélés après coloration ou marquage approprié, par exemple par l’utilisation d’un microscope à fluorescence.

La cellule comme usine de production : le bioréacteur miniPERM^®

La production efficace et en grande quantité de biomasse ou de produits cellulaires tels que les protéines est difficile dans les flacons de culture conventionnels, car elle nécessite non seulement beaucoup de travail, mais aussi l'espace nécessaire dans l'incubateur.

Au lieu de cela, il est préférable d’utiliser un bioréacteur qui alimente constamment vos cellules en milieu, évacue les produits finaux du métabolisme et assure un rendement aussi élevé que possible.

À l’échelle du laboratoire, nous souhaitons non seulement un rendement élevé, mais aussi une manipulation simple. La production dans le bioréacteur miniPERM® est idéale pour cela.

• Design bien pensé : le module de production de 35 ml est séparé du module d’approvisionnement de 400 ml par une membrane de dialyse et alimente ainsi efficacement vos cellules. Votre produit (< 12,5 kD) reste dans le module de production.

• Haute densité cellulaire : il est possible d’obtenir jusqu’à 1x10⁷ cellules/ml, ce qui correspond à environ 20 grands flacons de culture ou trois flacons d’un litre.

• Échange de gaz optimal : l’extérieur du module de production est constitué d’une membrane en silicone perméable à l’O₂ et au CO_2.

• Polyvalent : il est possible de cultiver les cellules de mammifères, de plantes et d’insectes les plus diverses.

• Peu encombrant et simple : grâce au dispositif rotatif universel, il est possible de placer jusqu’à quatre bioréacteurs dans l’incubateur, ce qui permet de gagner de la place.

Dépannage : vous pouvez éviter ces obstacles

Malgré tout le soin apporté et l’expérience, les difficultés résident parfois dans les détails. Voici des problèmes typiques et comment les éviter :

• Pipetage : un pipetage rapide stresse vos cellules et dans le pire des cas, elles peuvent être détruites par les forces de cisaillement. Lors du changement de milieu, la pointe de pipette ne doit pas toucher le fond du contenant de culture afin de ne pas endommager le tapis cellulaire.

• Centrifugation : ne centrifugez vos cellules que le temps et la vitesse nécessaires pour ne pas les stresser inutilement.

• Croissance cellulaire circulaire : les causes peuvent être des vibrations dans l’environnement. Votre incubateur se trouve-t-il à côté d’un vieux réfrigérateur ? Les collègues claquent-ils régulièrement la porte ? Des travaux de rénovation sont-ils en cours dans le laboratoire voisin ?

• Pas de croissance au milieu du puits : si le volume de liquide dans le puits est trop faible, le ménisque peut pousser les cellules vers le bord du puits. Si vos cellules s’y accumulent en haute densité, il peut y avoir une inhibition du contact et une croissance réduite ou nulle. Des quantités suffisantes de milieu de culture permettent de remédier à cette situation.

• Mycoplasmes : les bactéries invisibles au microscope optique peuvent gravement affecter ou modifier la croissance et le métabolisme de vos cellules. L’absence de paroi cellulaire les rend résistantes à de nombreux antibiotiques utilisés en laboratoire, comme la pénicilline, la streptavidine ou la gentamicine. Elles passent également assez facilement à travers des filtres stériles dont la taille des pores est inférieure à 0,2 µm. Des contrôles réguliers, à l’aide de tests de PCR, apportent une certitude quant à leurs absences tandis qu’une méthode de travail stérile réduit le risque.

• Contaminations croisées et authenticité : votre lignée cellulaire est-elle réellement ce que vous pensez qu’elle est ? La question est tout à fait justifiée, car les contaminations croisées sont bien présentes dans les laboratoires travaillant avec des lignées cellulaires variées. En amont et en aval du projet, il est donc utile de jeter un coup d’œil attentif à sa culture cellulaire.

Cryoconservation : conservez correctement les matériaux cellulaires

Où trouvez-vous habituellement vos cellules primaires ou vos lignées cellulaires ? Probablement dans le congélateur ou, mieux encore, un réservoir d’azote. La cryoconservation est un élément incontournable de la biologie cellulaire, car de nombreuses lignées cellulaires sont spécifiques à un projet et ne sont donc nécessaires que temporairement.

Une culture permanente n’est pas judicieuse car le temps, le matériel et la place prise dans l’incubateur peuvent être utilisés autrement. De plus, chaque passage supplémentaire augmente le risque que vos cellules entrent en sénescence ou développent des modifications génétiques ou morphologiques. Une banque de cellules soigneusement entretenue et stockée vous protège également contre la perte de lignées cellulaires entières en cas de contamination, de dysfonctionnement d’équipement ou d’erreur de manipulation.

Conservation des cellules : il n'y a (presque) pas de température trop basse

Dans de nombreux laboratoires, les cellules sont placées, au moins temporairement, dans un congélateur à ultra basse température d’environ -80 °C. Apparaissant comme suffisamment froid, il ne convient pas pour le stockage permanent de vos cellules. En effet, la formation de glace intracellulaire et la recristallisation peuvent entraîner une perte rapide de la viabilité.

Avec un stockage à < -130 °C dans la phase gazeuse de votre réservoir d’azote, vous optez pour la sécurité, mais vous avez besoin d’un matériel approprié qui résiste à ces températures. En effet, en dessous de -80 °C, les contenants plastique traditionnels en polypropylène ou en polycarbonate atteignent leurs limites.

Le matériel adéquat est proposé avec les solutions de congélation CryoPure , dont les tubes, les portoirs et les boîtes sont spécialement conçus pour ces températures.

Stable au froid jusqu’à < -196 °C : les tubes, portoirs et boîtes CryoPure sont optimisés pour des températures extrêmement froides

Ergonomique : ouverture facile du bouchon à vis en un seul tour, manipulation aisée grâce à un pied spécial, code couleur grâce à des bouchons et des inserts colorés.

Filtration dans la culture cellulaire : tout est-il bien stérile ?

L’autoclave et le poste de sécurité microbiologique (PSM) garantissent des matériaux et des conditions de travail stériles lors de vos travaux de culture cellulaire. Bien entendu, le milieu de culture, en tant que base vitale de vos cellules, doit également être la plus stérile possible. La stérilisation en autoclave n’est toutefois pas possible pour les composants thermolabiles. La filtration stérile vous donne néanmoins l’option d’éliminer en toute sécurité les champignons, les mycoplasmes et autres bactéries.

Les particules en suspension et les grosses particules peuvent généralement être éliminées avec un filtre de 0,45 µm, mais pour les bactéries ou les champignons, il faut utiliser un filtre de 0,22 µm. Si vous optez pour la sécurité concernant les mycoplasmes, il vaut mieux opter pour une taille de pores de seulement 0,1 µm. En raison de leur absence de paroi cellulaire, ces petites bactéries indésirables sont si souples qu’elles peuvent tout à fait passer à travers un filtre de 0,2 µm.

Degré de pureté dans la culture cellulaire : travaillez proprement !

Du temps, de l'argent, de l'énergie, du dévouement et une grande tolérance à la frustration : ceux qui travaillent dans le domaine scientifique ont généralement besoin de tous ces éléments. Dès le premier coup d'œil au microscope, il est clair que quelque chose ne va pas. Des cellules censées être adhérentes flottent mortes dans le milieu ou quelque chose qui ne devrait pas s'y trouver se développe.

Les essais et les erreurs ainsi que les succès et les échecs font partie du travail scientifique au même titre que la pipette dans la main ou le microscope sur la table. Toutefois, vous pouvez éviter des échecs inutiles en gardant un œil sur le degré de pureté de vos matériaux pour vos travaux de culture cellulaire et ce dès le départ.

Plusieurs facteurs jouent à ce titre un rôle essentiel :

• Stérilité : garantit qu’aucune bactérie ou qu’aucun champignon viable n’est introduit dans votre culture.

• Apyrogène/sans endotoxine : les substances pro-inflammatoirespeuvent rester sur le matériau, même s’il n’y a plus de bactéries vivantes.

• Non cytotoxique : pour une croissance cellulaire vitale, aucune substance cytotoxique ne doit être introduite dans votre culture.

• Absence d’ADN : préserve l’authenticité de votre lignée cellulaire, car dans certaines conditions, l’ADN étranger du milieu peut être absorbé par les cellules et intégré au génome.

• TC Tested : les produits présentant ce degré de pureté ne répondent pas seulement aux exigences susmentionnées, mais sont également exempts de DNase et de RNase.

Obtenez un aperçu de nos degrés de pureté et de la « SARSTEDT QUALITY