Cultivo celular

De expertos para expertos

En las ciencias de la vida se aplica lo siguiente: la biología celular no lo es todo, pero sin biología celular todo es nada. Casi todas las hipótesis científicas, por buenas que sean, deben demostrar primero su validez en la unidad más pequeña de la vida, la célula. Por ello, el cultivo celular se ha convertido en parte integrante de la investigación básica y farmacológica. Tanto si se trata de la elucidación de vías de señalización complejas, el desarrollo de fármacos, estudios de eficacia y toxicidad o de la reducción de los ensayos con animales de acuerdo con las 3R. Todo esto sería difícilmente concebible sin modelos celulares. La variedad de líneas celulares y sistemas de cultivo a su disposición es ahora enorme. Células primarias y secundarias o líneas celulares, en suspensión o adherentes, cultivadas en dos o tres dimensiones: la elección correcta es crucial para el éxito de su trabajo científico. ¿Qué hay que tener en cuenta?

Con SARSTEDT, tendrá a su lado un socio fiable para todas estas cuestiones. Nuestros experimentados expertos trabajarán con usted para identificar sus necesidades específicas y encontrar la solución óptima a partir de nuestra amplia cartera de productos. Con nuestros recipientes de cultivo, biorreactores y sistemas de almacenamiento y filtración de alta calidad, disponemos de las herramientas adecuadas para todas las tareas. Descubra nuestras soluciones innovadoras y benefíciese de nuestra experiencia en biología celular.

Células y líneas celulares: el dilema de elegir

La primera pregunta, y la más importante, suele ser: ¿qué línea celular es adecuada para responder a su pregunta? Para ello pueden utilizarse células primarias y líneas celulares secundarias.

• Las células primarias se aíslan directamente de tejidos humanos o animales o de fluidos corporales. Proporcionan resultados más significativos que las líneas celulares secundarias, ya que reflejan con exactitud las características morfológicas y fisiológicas del tejido del que se extrajeron. Sin embargo, la vida útil y la proliferación son finitas y lentas, y el cultivo suele llevar más tiempo y ser más complejo.

• En cambio, las líneas celulares secundarias, como las células HeLa, HEK-293 o CHO, son capaces de una división y supervivencia ilimitadas (inmortalizadas). Son fáciles de cultivar utilizando protocolos establecidos, se dividen más rápidamente y están disponibles comercialmente a un coste relativamente bajo. Sin embargo, reproducen las propiedades fisiológicas del tejido original con mucha menos precisión que las células primarias.

Una vez que haya seleccionado las células o líneas celulares adecuadas para su interrogante investigado, vale la pena comprobar algunos puntos:

• Autenticidad: ¿Existe realmente la línea celular o el tipo de célula correctos?

• Contaminación: ¿Está el cultivo libre de micoplasmas, virus, levaduras o contaminación cruzada de otras células?

• Pases bajos: Las líneas celulares inmortalizadas, por ejemplo, las células tumorales, suelen presentar una gran inestabilidad genética y pueden degenerar tras pases frecuentes. Por lo tanto, ¿el número de pases es bajo?

Condiciones de cultivo: ¡todo debe estar en orden!

Independientemente de si trabaja con células primarias o líneas celulares secundarias, las condiciones específicas de cultivo desempeñan un papel decisivo. En este sentido, se comienza con la selección del recipiente de cultivo .

Las células que se adhieren a las superficies presentan necesidades diferentes a las células cultivadas en suspensión:

• Los recipientes de cultivo hidrófilos ofrecen un sustrato de cultivo óptimo para las células adherentes. Además facilitan la adsorción inicial y la posterior adhesión de las células.

• Los recipientes de cultivo hidrófilos con grupos polares adicionales facilitan además la adsorción y adhesión de células primarias o líneas celulares sensibles.

• En cambio, los recipientes de cultivo hidrófobos reducen la adhesiónde las células de suspensión y las mantienen en solución.

Especialmente con células adherentes, la superficie del recipiente de cultivo debe ser absolutamente plana para que sus células formen una capa celular uniforme y no se asienten en los bordes.

Dependiendo de la aplicación, existen diferentes recipientes de cultivo:

• Frascos: Para recuentos celulares elevados, alta protección contra la contaminación gracias al tapón de rosca

• Placas: Para recuentos celulares medios

• Placas de pocillos: Para un número reducido de células, por ejemplo en experimentos paralelos

Además del recipiente de cultivo adecuado, los medios de cultivo, los factores ambientales y el factor humano también desempeñan un papel decisivo.

Cultivo celular tridimensional: ¡gíralo!

Los cultivos celulares bidimensionales clásicos son adecuados para una gran cantidad de cuestiones de investigación fundamentales. Sin embargo, los resultados de una sola capa de células idénticas pueden transferirse a un tejido, si bien de forma escasa y muy limitada, aún más si se trata de un órgano o incluso de todo un organismo.

Para abordar lo más posible esta complejidad, los cultivos en esferoides desempeñan un papel cada vez más importante en la investigación de las ciencias de la vida:

• Forman contactos célula-célula y célula-matriz.

• Estos pueden componerse de diferentes tipos de células.

• Su estructura tridimensional garantiza gradientes de nutrientes, oxígeno o principios activos.

• El objetivo del cultivo celular tridimensional es, por tanto, cerrar esta brecha entre la situación in vitro e in vivo.

• Además, pueden contribuir a reducir las pruebas con animales.

BIOFLOAT^TM: cultivo de esferoides rápido y reproducible

Lo ideal es generar esferoides uniformes de forma rápida y reproducible, incluso cuando se trata de líneas celulares complejas. La placa de cultivo celular adecuada puede facilitarle considerablemente el trabajo y producir resultados muy mejorados.

Gracias a su superficie robusta y altamente antiadherente, BIOFLOAT^TM garantiza que las células adherentes formen preferentemente contactos célula-célula. En comparación con otras superficies antiadherentes, esto aporta las siguientes ventajas para su cultivo en 3D:

• Formación más rápida de esferoides solo 2-24 horas después, dependiendo de la línea celular

• Mayor reproducibilidad gracias a esferoides sumamente uniformes y redondos

• Formación fiable de esferoides, incluso con líneas celulares exigentes

Como ocurre con la placa de cultivo celular de 96 pocillos en dimensiones estándarANSI/SLAS , la placa BIOFLOAT^TMcon estas propiedades es apta para procedimientos automatizados de alto rendimiento, por ejemplo en la fase preclínica de la investigación farmacológica, en estudios toxicológicos y en la investigacióndel cáncer .

Inserts TC para experimentos complejos en cultivos celulares y de tejidos

Además del cultivo de esferoides, también pueden conseguirse condiciones in vivo utilizando placas de cultivo celular y los correspondientes insertos CC correspondientes:

• El sistema de 2 compartimentos proporciona a sus células un entorno similar a la situación in vivo.

• Los insertos están equipados con una membrana microporosa ultrafina que permite una adhesión celular óptima.

El sistema de 2 compartimentos le permite llevar a cabo experimentos complejos, por ejemplo, estudios de transporte, secreción y difusión, cocultivos, cultivos celulares en 3D como modelos organotípicos de piel, entre otros.

Las células en el centro de atención: productos para microscopía celular

Una película lechosa en el fondo del recipiente de cultivo o un brillo turbio en el medio de cultivo en suspensión es lo máximo que puede detectarse a simple vista. Las células de mamíferos miden entre 1 y 30 µm y las células humanas, una media de unas 25 µm. El estado o el crecimiento de su cultivo celular puede evaluarse únicamente mediante microscopía óptica. Otros detalles, como los orgánulos específicos, las moléculas de superficie o la expresión de determinados productos génicos, pueden revelarse -tras la tinción o el etiquetado adecuados- utilizando, por ejemplo, un microscopio de fluorescencia.

La planta de producción de células: el biorreactor miniPERM^®

Producir biomasa o productos celulares como proteínas de forma eficaz y en grandes cantidades resulta un reto en los frascos de cultivo convencionales. Aparte de mucho trabajo, también requiere el espacio necesario en la incubadora.

En su lugar, puede utilizar un biorreactor que suministre constantemente medio a sus células, elimine los productos metabólicos de desecho y garantice el mayor rendimiento posible.

A escala de laboratorio, no solo queremos un alto rendimiento, sino también una manipulación sencilla. En este sentido, la producción en el biorreactor miniPERM® resulta ideal.

• Diseño sofisticado: El módulo de producción de 35 o 50 ml está separado del módulo nutriente de 400 ml por una membrana de diálisis y, de este modo, abastece a sus células de forma eficaz. Su producto (< 12,5 kD) permanece en el módulo de producción.

• Alta densidad celular: Son posibles hasta 1x107 células/ml, lo que corresponde a unos 20 frascos de cultivo grandes o tres frascos cilíndricos de 1 litro.

• Intercambio gaseoso óptimo: El exterior del módulo de producción está formado por una membrana de silicona permeable al O₂ y al CO₂.

• Versátil: Se puede cultivar una gran variedad de células de mamíferos, plantas e insectos.

• Sencillo y compacto: En el incubador se pueden alojar hasta cuatro biorreactores ahorrando espacio gracias a un dispositivo de giro universal.

Solución de problemas: Es posible evitar los siguientes obstáculos

A pesar del cuidado y la experiencia, a veces la dificultad se oculta en los pormenores. Problemas típicos y cómo evitarlos:

• Pipeteo: El pipeteo rápido estresa las células y, en el peor de los casos, puede destruirlas debido a las fuerzas de cizallamiento. Al cambiar el medio, la punta de la pipeta no debe tocar el fondo del recipiente de cultivo para no dañar la capa celular.

• Centrifugado: Centrifugue las células solo el tiempo y a la velocidad necesarios para no someterlas a un estrés innecesario.

• Crecimiento celular circular: Esto puede deberse a las vibraciones del entorno. ¿Su incubadora está situada al lado de un frigorífico antiguo? ¿Sus compañeros suelen dar portazos? ¿El laboratorio vecino se encuentra actualmente en obras?

• No existe crecimiento en el centro del pocillo: Si el volumen de fluido en el pocillo es demasiado bajo, el menisco puede empujar las células hacia el borde del pocillo. Si sus células se acumulan aquí en alta densidad, puede producirse una inhibición del contacto y un crecimiento reducido o nulo. Unas cantidades suficientes de medio de cultivo ayudan a corregir la situación.

• Micoplasmas: Las bacterias invisibles al microscopio óptico pueden perjudicar o alterar gravemente el crecimiento y el metabolismo de las células. Al carecer de pared celular, son resistentes a numerosos antibióticos utilizados en el laboratorio, como la penicilina, la estreptamicina o la gentamicina. También atraviesan sin problemas filtros estériles con un tamaño de poro de hasta 0,2 µm. Los controles regulares, por ejemplo con pruebas basadas en la PCR, proporcionan seguridad. Asimismo, un método de trabajo estéril reduce el riesgo.

• Contaminación cruzada y autenticidad: ¿Es su línea celular lo que realmente cree que es? La pregunta está bastante justificada, ya que la contaminación cruzada se produce en laboratorios en los que se utiliza una gran variedad de líneas celulares. Por lo tanto, merece la pena examinar detenidamente su propio cultivo celular antes y después de un proyecto.

Almacenamiento correcto de los materiales celulares: crioconservación

¿De dónde suele obtener sus células primarias o líneas celulares? Presumiblemente del frigorífico, mejor aún, de un tanque de nitrógeno. La crioconservación es una parte integral de la biología celular, ya que muchas líneas celulares solo se necesitan temporalmente para proyectos específicos.

El cultivo permanente no resulta razonable por varias razones. Es mejor invertir el tiempo, los materiales y el espacio de la incubadora en otra cosa. Además, el riesgo de que sus células entren en senescencia o desarrollen cambios genéticos o morfológicos aumenta con cada pase adicional. Un banco de células cuidadosamente mantenido y almacenado también le protege contra la pérdida de líneas celulares enteras en caso de contaminación, fallo del equipo o errores de manipulación.

Almacenamiento celular: el frío en exceso (prácticamente) no existe

En muchos laboratorios, las células se almacenan, al menos temporalmente, en un frigorífico de temperatura ultrabaja a unos -80 °C. Aparentemente bastante frío, pero inadecuado para el almacenamiento a largo plazo de sus células. Esto se debe a que la formación de hielo intracelular y la recristalización pueden provocar una rápida pérdida de viabilidad.

El almacenamiento a <-130 °C en la fase gaseosa de su depósito de nitrógeno es seguro, pero necesita un material adecuado que pueda soportar estas temperaturas. Ya que por encima de -80 °C, los recipientes de plástico convencionales de polipropileno o policarbonato muestran sus limitaciones.

El material adecuado lo proporciona el sistema de congelación CryoPure cuyos tubos, gradillas y cajas están especialmente diseñados para someterse a estas temperaturas.

Estable al frío hasta <-196 °C: Los tubos, gradillas y cajas CryoPure están optimizados para temperaturas extremadamente frías

Ergonómico: Fácil apertura del tapón de rosca con una sola vuelta, manipulación sencilla gracias al soporte especial, codificación por colores con tapones y plaquitas de codificación de colores

Filtración en el cultivo celular: ¿todo es estéril?

El autoclave y la cabina de seguridad garantizan unas materiales y unas condiciones de trabajo estériles para su trabajo de cultivo celular. Por supuesto, la forma de subsistencia de sus células también debe ser lo más estéril posible: hablamos del medio de cultivo. Sin embargo, la esterilización en autoclave no es una opción para los componentes termolábiles. La filtración estéril continúa ofreciéndole la opción de eliminar de forma segura hongos, micoplasmas y otras bacterias.

Las partículas en suspensión y las partículas de mayor tamaño pueden eliminarse de la forma habitual con un filtro de 0,45 µm. No obstante, en el caso de las bacterias y los hongos, debe utilizarse un filtro de 0,22 µm. Si quiere ir sobre seguro en cuanto al micoplasma, lo mejor es utilizar un tamaño de poro de solo 0,1 µm. Debido a su falta de pared celular, las pequeñas plagas son tan maleables que pueden pasar fácilmente a través de un filtro de 0,2 µm.

Niveles de pureza en el cultivo celular: ¡fuera concesiones!

Tiempo, dinero, energía, pasión y mucha tolerancia a la frustración: cualquiera que trabaje en el terreno de la ciencia suele tener que aportar todo esto. Casi todos los investigadores conocen esa sensación: incluso a primera vista a través del microscopio, está claro que algo no ha ido como se esperaba. Las células realmente adherentes vagan muertas por el medio o crece algo que no debería crecer allí.

El ensayo y el error, los éxitos y los fracasos forman parte del trabajo científico tanto como la pipeta en la mano o el microscopio sobre la mesa. Sin embargo, se pueden evitar contratiempos innecesarios vigilando desde el principio los niveles de pureza de los materiales para su trabajo de cultivo celular.

Aquí intervienen varios factores:

• Esterilidad: Garantiza que no penetren bacterias ni hongos viables en su cultivo.

• Apirógeno/libre de endotoxinas: Las sustancias proinflamatoriaspueden permanecer en el material aunque no existan bacterias vivas.

• No citotóxico: Para garantizar un crecimiento celular vital, no deben penetrar en su cultivo sustancias citotóxicas.

• Sin ADN: Preserva la autenticidad de su línea celular, ya que en determinadas condiciones el ADN extraño del medio puede ser captado por las células e integrarse en el genoma.

• Probado para CC: Los productos con este grado de pureza no solo cumplen los requisitos mencionados, sino que también están libres de DNasa y RNasa.

Obtenga una visión general de nuestros grados de pureza y la CALIDAD SARSTEDT.