Совет месяца: Более точные ПЦР в реальном времени с белыми ПЦР-пробирками

Совет месяца: Более точные ПЦР в реальном времени с белыми ПЦР-пробирками

Улучшенная воспроизводимость - оптимизированная чувствительность – снижение взаимных помех

В анализах на основе измерения флуоресценции, таких как ПЦР в реальном времени (qPCR), при использовании небольших объёмов особенно актуальны преимущества улучшенных отражательных свойств белых расходных материалов для ПЦР. Тем не менее, в настоящее время при проведении qPCR чаще применяются прозрачные материалы. Узнайте здесь, как можно легко улучшить результаты qPCR.

Как использование белых ПЦР-пробирок влияет на воспроизводимость?

Благодаря максимальному отражению белых пробирок флуоресцентный свет «не теряется» в стенках лунок и, соответственно, количество флуоресцентного света, достигающего детектор, более постоянно, чем при использовании прозрачных изделий. В результате достигается снижение рассеяния при обнаружении вторых и третьих экземпляров и при повторе экспериментов. Прозрачный и

Прозрачный и белый планшеты ПЦР в сравнении

Как можно добиться улучшенного соотношения сигнал / фон?

Ввиду в несколько раз более высокого уровня флуоресценции белых расходных материалов для ПЦР и неизменных фоновых эффектов из-за используемого люминофора достигается улучшенное соотношение сигнал / фон в белых пробирках.

Можно ли избежать взаимных помех («crosstalk») между отдельными лунками?

При использовании прозрачных лунок может происходить детектирование флуоресценции от соседних лунок из-за рассеяния флуоресцентного света. Благодаря полной светонепроницаемости белых расходных материалов детекторы флуоресценции в термоциклере не могут обнаруживать сигналы флуоресценции от соседних лунок.

Как использование белых ПЦР-пробирок влияет на чувствительность ПЦР?

На этом вопросе мы хотели бы остановиться подробно, на примере сравнительного эксперимента qPCR. Показанный на рис. 1 результат опыта иллюстрирует, что измеренная интенсивность флуоресценции при равных количествах матрицы в белых пробирках значительно выше, чем в прозрачных. Для прозрачных и для белых ПЦР-стрипов на рис. 1 пороговое значение автоматически рассчитывалось в термоциклере независимо друг от друга. Для обнаружения 1000 молекул матрицы в прозрачных пробирках было рассчитано среднее значение Cq = 24,87 ± 0,08 (n = 8), а для белых пробирок - значение Cq = 23,40 ± 0,07. Это значит, что в белых пробирках обнаружение происходит раньше. Это является особенным преимуществом, когда в наличии есть лишь небольшие объёмы проб. Таким образом, благодаря использованию белых расходных материалов возможно успешное обнаружение молекул в тех случаях, когда с прозрачными материалами проведение ПЦР нецелесообразно.

Сравнение уровня флуоресценции в белых и прозрачных лунках

Рис.1 Сравнительный ПЦР-анализ ПЦР-стрипа 72.985.002 (прозрачного) и 72.985.092 (белого) после закрытия высокопрозрачным стрипом крышек 65.989.002. Амплификации подвергался фрагмент 100 bp плазмида EmGFP (количество матрицы: 1000 молекул) в объёме 20 мкл в термоциклере Eppendorf realplex 4S (n = 8).

В чём заключается экономический аспект уменьшения объёма при проведении опытов?

Так как с белыми расходными материалами для ПЦР достигается гораздо более высокий уровень флуоресценции, становится возможным значительное сокращение объёма проб и тем самым количества используемых реагентов (ферментов, зондов, праймеров и др.). Тем самым возможна экономия расходов на реагенты.

Вывод:

применение белых расходных материалов для ПЦР несёт существенные преимущества, которые не следует игнорировать. Не компрометируйте свои результаты только для того, чтобы иметь возможность визуального контроля лунок сбоку или снизу!