Consejo del mes: PCR en tiempo real más precisas con recipientes de PCR blancos

Consejo del mes: PCR en tiempo real más precisas con recipientes de PCR blancos

Reproducibilidad mejorada - Sensibilidad optimizada – Prevención de reacciones cruzadas (crosstalk)

Las aplicaciones basadas en fluorescencia, como la PCR en tiempo real (qPCR), se benefician de las propiedades de reflexión significativamente mejoradas de los consumibles para PCR blancos, sobre todo con volúmenes reducidos. No obstante, actualmente todavía se utilizan consumibles transparentes para realizar las qPCR. Descubra aquí cómo mejorar de forma sencilla sus qPCR.

¿Cómo influye la utilización de recipientes de PCR blancos en la reproducibilidad?

Por una parte, gracias a la reflexión máxima de la fluorescencia de los recipientes blancos, no se pierde luz fluorescente a través de la pared de los pocillos. Por otra, la cantidad de luz fluorescente que alcanza el detector es más constante que al utilizar productos transparentes. Así obtendrá una menor dispersión en la detección de duplicados o triplicados, así como en la repetición de ensayos.

Placa de PCR transparente y blanca en comparación

¿Por qué es posible una mejor relación señal / fondo?

Debido al nivel mayor de fluorescencia de los consumibles para PCR blancos y a los efectos de fondo constantes por el fluoróforo utilizado, se obtiene una mejor relación señal / fondo en los recipientes de PCR blancos.

¿Se pueden evitar las reacciones cruzadas (crosstalk) entre los diferentes pocillos?

Al utilizar pocillos transparentes, la dispersión de la luz fluorescente puede provocar la detección de la fluorescencia de los pocillos colindantes. Debido a la tinción completa y opaca de los consumibles para PCR blancos, los detectores de fluorescencia del termociclador ya no detectan las señales de fluorescencia de los pocillos colindantes.

¿Qué incidencia tiene la utilización de recipientes de PCR blancos en la sensibilidad de la PCR?

A continuación se presenta un ensayo de qPCR comparativo. El resultado del ensayo representado en la Fig. 1 muestra, en primer lugar, que con idéntica cantidad de plantilla, la intensidad medida de la fluorescencia es notablemente mayor en los recipientes blancos que en los recipientes transparentes. Para las tiras para PCR transparentes y blancas de la Fig. 1, el termociclador calculó automáticamente el umbral por separado. Para la detección de las 1.000 moléculas de plantilla en los recipientes transparentes, se calculó un valor Cq medio (n = 8) de 24,87 ± 0,08, y para los recipientes blancos un valor Cq de 23,40 ± 0,07. Esto significa que en los recipientes blancos la detección se realiza antes. Esta particularidad constituye una ventaja, especialmente si sólo se dispone de volúmenes de muestra reducidos. En consecuencia, si con los consumibles transparentes ya no es posible un ciclo de PCR útil, con los consumibles blancos aún se puede obtener una detección correcta.

Comparación del nivel de fluorescencia de pocillos blancos y transparentes

Fig. 1 Ciclo de PCR comparativo de las tiras para PCR 72.985.002 (transparente) y 72.985.092 (blanca), cerrados con la tira de tapas altamente transparentes 65.989.002. Se amplificó un fragmento de 100 bp del plásmido EmGFP (cantidad de plantilla: 1.000 moléculas) en un volumen de 20 μl con el termociclador Eppendorf realplex 4S (n = 8).

¿Cómo reducir económicamente el volumen de las preparaciones para ensayos?

Los consumibles para PCR blancos aportan un nivel de fluorescencia mayor, lo que permite reducir notablemente el volumen de las preparaciones de ensayo y, por consiguiente, las cantidades de los reactivos utilizados (enzima, sonda, cebador, etc.). El resultado es un ahorro en costes de reactivos.

Conclusión:

El uso de consumibles para PCR blancos conlleva ventajas considerables a tener en cuenta. ¡No comprometa sus resultados sólo por comprobar visualmente los pocillos desde el lateral o desde abajo!